北京大学，最新Nature Materials：个性化癌症免疫治疗新突破！

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北京大学，最新Nature Materials：个性化癌症免疫治疗新突破！

癌症疫苗作为免疫治疗的前沿策略，通过激活适应性免疫应答来增强抗肿瘤免疫力，潜力巨大。然而，其疗效高度依赖于免疫原性，即抗原与佐剂的组合效果。由于肿瘤抗原存在显著的个体间和个体内异质性，开发个性化的新抗原疫苗成为迫切需求。尽管基因组测序和mRNA技术的进步推动了个性化疫苗的发展，但高昂的成本和复杂的制备工艺依然是阻碍其广泛应用的巨大挑战。原位癌症疫苗接种需要精确调控“癌症-免疫循环”（CIC）的多个关键步骤，包括肿瘤细胞抗原释放、抗原呈递细胞（APC）加工呈递以及效应T细胞的杀伤。然而，CIC中各步骤的限速效应以及免疫抑制的肿瘤微环境，严重制约了高效抗肿瘤免疫应答的激活。因此，亟需一种能够高效放大CIC、且能规避系统毒性的新策略。

北京大学汪贻广教授、张强教授、陈斌龙副研究员合作，报道了一种可通过系统注射、并能诱导焦亡的纳米佐剂（SPEN）。该纳米佐剂可在肿瘤区域引发强烈的免疫原性焦亡，触发富含肿瘤抗原的“焦亡小体”（pyroptosome）、损伤相关分子模式（DAMPs）和促炎细胞因子的高效释放。通过光激活作用，该纳米佐剂能在焦亡小体中释放TLR7/8激动剂，从而在原位生成一个癌症疫苗平台，协同激活整个“癌症-免疫循环”，同时避免全身毒性。这种疫苗能同时增强先天性和适应性免疫应答，有效清除原发肿瘤和转移结节，并提供持久的癌症预防效果。该研究为开发更高效的个性化癌症免疫疗法提供了新思路。相关论文以“In situ-generated vaccine-like pyroptosome for personalized cancer immunotherapy”为题，发表在Nature Materials！

从精准调控细胞死亡到重塑免疫微环境

为了攻克这一难题，研究团队利用其先前开发的“焦亡纳米调谐器”技术，通过一种具有高膜亲和力的纳米光敏剂（PEPA），实现了对细胞死亡方式的精准调控。研究发现，通过增加纳米颗粒与早期内体（EE）膜的亲和力，可以高效诱导癌细胞发生焦亡，而与之对照的溶酶体（Ly）应激则诱导免疫沉默的凋亡。通过对一系列共聚物的筛选，团队发现PEPA凭借其对负电荷内膜的强结合能力，在pH 6.0的早期内体环境中产生强烈的氧化应激，从而激活PLC-γ1/Ca²⁺/caspase-3信号轴，导致GSDME蛋白裂解并释放执行焦亡的N端结构域（GSDME-N），引发典型的细胞肿胀、气泡喷发和膜破裂。

 SPEN通过原位光生成疫苗样焦亡小体增强癌症-免疫循环的示意图。 a. pH和光双重响应的纳米佐剂的设计，通过早期内体靶向应激诱导肿瘤细胞发生特异性免疫原性焦亡，用于原位癌症疫苗接种。 b. SPEN在血液循环和细胞外分布期间保持焦亡诱导和佐剂活性的“关闭”状态。在肿瘤蓄积和细胞内吞后，SPEN通过早期内体定位的氧化应激特异性诱导肿瘤细胞焦亡并释放TLR受体激动剂IMDQ（SPENEE），从而同步激活癌症-免疫循环和佐剂活性。凭借高效的焦亡诱导活性，SPEN技术根除原发肿瘤后，产生包含肿瘤抗原和IMDQ的疫苗样焦亡小体。通过特异性扩增肿瘤组织中巨噬细胞和树突状细胞的抗原提呈能力，焦亡小体作为原位疫苗启动肿瘤和淋巴结的免疫微环境，实现强效且持久的癌症免疫治疗。TIME，肿瘤免疫微环境；GranB，颗粒酶B；iDC，未成熟树突状细胞；mDC，成熟树突状细胞。 

纳米颗粒的膜亲和力调控早期内体应激诱导的焦亡。 a. 增加光敏剂功能化的可电离共聚物的早期内体膜亲和力以提高焦亡诱导活性的示意图。 b. EPA单元百分比与A549细胞膜结合能力（通过流式细胞术和荧光成像测量）以及在pH 6.0条件下氧化应激诱导的纳米光敏剂乳酸脱氢酶释放呈正相关。数据以平均值表示。虚线中的误差带和阴影显示了通过双尾Student's t检验分析的拟合线的95%置信区间。 c. 含EPA的纳米光敏剂（3 μg ml⁻¹ PPa，相当于40 μg ml⁻¹聚合物，在质子化和无照射条件下具有可忽略的物理膜破坏）的膜结合在660 nm照射（6 J cm⁻²）下引起pH 6.0而非pH 7.4的红细胞溶血。 d. PEPA和PDPA在一系列以0.2 pH单位递增的PBS缓冲液中稀释的荧光图像（384孔板）。 e. 在4°C下与A549细胞孵育15分钟后，PEPA和PDPA（红色）的膜结合情况。比例尺，20 μm。 f. 通过ITC在pH 6.0下测量纳米光敏剂与ALM之间的纳米-生物相互作用。 h. 通过高速/智能超分辨率结构照明显微镜观察的内吞细胞器膜（绿色）与尼罗红标记的PEPA和PDPA（红色）之间的相互作用。比例尺，10 μm。 i. PEPA和PDPA介导的EE应激（纳米颗粒内化后0.5小时进行660 nm照射介导的EE应激）对A549细胞的细胞活力曲线，通过MTT法测量。 j. 用PEPAEE和PDPAEE处理的A549细胞中PLC-γ1磷酸化和GSDME切割的免疫印迹。切割的GSDME-N是焦亡的关键执行者，在质膜上形成孔。PLC-γ1，磷脂酶C-γ1；p-PLC-γ1，磷酸化的PLC-γ1；GSDME-FL，全长GSDME；GSDME-N，GSDME的N端。 k. 内体-溶酶体应激控制癌细胞焦亡和凋亡的示意图。细胞用PEPA脉冲处理30分钟，然后在37°C下追踪内体成熟。分别在0小时和2小时进行660 nm照射（6 J cm⁻²）以诱导EE和Ly应激。 l. 由PEPAEE或PEPALy应激诱导的CT26细胞死亡形态的代表性相差图像。比例尺，20 μm。 m. PEPAEE和PEPALy应激对CT26细胞的细胞活力曲线，通过MTT法测量。 n. PEPAEE和PEPALy应激对一系列小鼠癌细胞系的IC50值。 o. 用PEPAEE应激处理的各种小鼠癌细胞中GSDME切割的免疫印迹。下标EE或Ly分别表示在纳米颗粒处理后0.5小时或2小时进行660 nm照射（6 J cm⁻²）。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3个生物学独立实验）。 

进一步的研究证实，早期内体应激诱导的焦亡能极大地增强肿瘤的免疫原性。蛋白质组学分析显示，与凋亡细胞相比，焦亡的CT26癌细胞释放了更多样、更丰富的蛋白质，特别是富集了肿瘤抗原、DAMPs（如HMGB1、ATP）以及与免疫应答相关的信号分子。当将这些焦亡细胞与骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）共培养时，DCs的成熟标志物（CD80/CD86）显著上调，OVA抗原呈递能力增强，并大量分泌IL-12和TNF-α等细胞因子。在体内实验中，对荷瘤小鼠进行早期内体应激治疗后，其引流淋巴结中的DCs成熟度和抗原呈递能力均显著高于凋亡诱导组，并产生了高达91.2%的OVA特异性细胞杀伤效果，为机体提供了长达25天的肿瘤预防能力。

 EE应激诱导的焦亡调控癌细胞的免疫原性。 a. PEPA介导的内体-溶酶体应激调控癌细胞免疫原性的示意图。 b–e. 对经PEPA介导的EE或Ly应激处理的CT26细胞释放的蛋白质水平进行的蛋白质组学分析。 b. 释放蛋白质的维恩图。 c. 基因本体论中由PEPAEE特异性诱导的生物学过程的富集情况。 d. PEPA介导的EE和Ly应激诱导的释放蛋白的火山图。 e. PEPAEE和PEPALy之间显著改变的蛋白质类型的热图和聚类分析。采用Welch校正的双尾Student's t检验。n = 3个生物学独立实验。 f. PEPAEE或PEPALy应激处理后CT26细胞的CRT暴露情况。 g. 与PEPAEE或PEPALy处理的CT26-OVA细胞共培养后，BMDCs上共刺激因子（CD80和CD86）的过表达和OVA抗原（SIIN，SIINFEKL-H-2Kb）的提呈情况。数据通过流式细胞术量化并归一化至PBS处理组。 h. 用PEPAEE或PEPALy应激处理的CT26-OVA肿瘤中GSDME切割和caspase-3激活的免疫印迹。 i. PEPAEE或PEPALy引发的肿瘤组织免疫原性（TUNEL、CRT暴露和HMGB1释放）的全切片成像。比例尺，2 mm。 j,k. 经PEPAEE或PEPALy处理后，从荷CT26-OVA瘤小鼠收集的引流淋巴结中DC的体内活化和OVA提呈情况。 j. CD80⁺CD86⁺ DC细胞的百分比，n = 5只小鼠。 k. 抗原阳性DC中SIINFEKL展示的量化，n = 4只小鼠。MFI，平均荧光强度。 l. 不同处理后荷CT26-OVA瘤小鼠中的特异性细胞杀伤研究（n = 5只小鼠）。 m. 用CT26细胞再次攻击后，经PEPAEE或PEPALy处理的荷CT26瘤小鼠的肿瘤发生情况。n = 6只小鼠；对数秩检验；WT-PEPAEE与WT-PEPALy相比，P = 0.0061。所有数据以平均值 ± 标准差表示，所有测量值（n）均为生物学独立重复。对于j–l，统计学显著性通过单因素方差分析随后进行Dunnett多重比较检验进行分析。

基于此，团队设计了最终的SPEN纳米佐剂。它将TLR7/8激动剂（IMDQ）通过活性氧敏感键偶联到PEPA上，实现了光控和肿瘤特异性的佐剂释放。实验证明，SPEN在血液循环中保持“关闭”状态，避免了游离IMDQ引起的体重下降、脾肿大、细胞因子风暴等全身免疫毒性，极大地提高了治疗安全性。SPEN在肿瘤富集并经光照后，能高效释放IMDQ，激活免疫细胞。

最令人兴奋的是，SPEN介导的早期内体应激能促使癌细胞产生大量的“焦亡小体”。通过差速离心纯化后，研究团队发现这些微米级的囊泡中富集了早期内体、肿瘤抗原（OVA）、DAMPs（CRT）以及被激活释放的IMDQ（图4a-c）。这些焦亡小体如同一款“即用型”的自体疫苗，注射到小鼠足垫后，能高效地引流至淋巴结，并被DCs和巨噬细胞等抗原呈递细胞摄取（图4g-h）。在小鼠体内，接种焦亡小体能显著诱导淋巴结肿大，并使其中成熟DCs的比例提升4.1倍（图4i-j）。在自发的MMTV-PyMT乳腺癌转基因模型中，用自体肿瘤制备的焦亡小体进行免疫，可使小鼠的肿瘤数量减少67.1%，总肿瘤重量减轻89.4%（图4k-n），展现了强大的个性化免疫预防潜力。

 SPEN衍生的焦亡小体作为癌症疫苗发挥作用。 a. 从经SPEN_EE应激处理后的焦亡癌细胞中纯化焦亡小体。 b. 经SPEN_EE应激处理后，CT26细胞来源的焦亡小体的共聚焦图像。CT26细胞转染了Rab5a-GFP，10 nm AuNP被包裹在SPEN中。比例尺，500 nm。 c. 焦亡小体和细胞膜中GSDME-N、CRT和OVA的免疫印迹。 d. 通过Raw-Blue报告细胞实验检测经PEPA_EE或SPEN_EE应激处理的CT26细胞来源的焦亡小体的TLR激活功效。数据显示为平均值 ± 标准差（n = 3个生物学独立实验）。 e. 与CT26-OVA细胞来源的焦亡小体孵育后，BMDCs上共刺激因子（CD80和CD86）的过表达和OVA抗原（SIINFEKL-H-2K）的提呈情况。 f. BALB/c小鼠在足垫皮下接种焦亡小体进行癌症疫苗接种。 g. 焦亡小体淋巴结引流的体内荧光成像。小鼠足垫注射DiR标记的焦亡小体或SPEN处理的CT26细胞。 h. 淋巴结内焦亡小体DIR⁺细胞中各种免疫细胞的比例。 i. 用不同焦亡小体免疫的小鼠淋巴结中CD11c⁺ DC中CD80⁺ CD86⁺ DC亚群的代表性等高线图。 j. 淋巴结的代表性照片及用Opal多重染色（CD4，红色；CD8，绿色；CD11c，黄色；F4/80，青色）的相应切片。副皮质T细胞区域用白色虚线标出。比例尺，2 mm。 k–n. SPEN衍生的焦亡小体在MMTV-PyMT模型上的个性化癌症疫苗接种。 k. 未发生肿瘤的MMTV-PyMT/FVB小鼠用取自MMTV-PyMT/FVB小鼠自发肿瘤制备的焦亡小体进行免疫。 l. 用PBS或SPEN衍生的焦亡小体免疫的MMTV-PyMT小鼠的代表性照片。 m. 免疫后MMTV-PyMT小鼠切取的乳腺肿瘤组织照片。比例尺，1 mm。n = 10只生物学独立小鼠。 n. 切取乳腺肿瘤的重量。数据显示为平均值 ± 标准差；n = 10只生物学独立小鼠；采用Welch校正的双尾Student's t检验。 

在作用机制上，SPEN介导的原位疫苗能全面激活“癌症-免疫循环”。它不仅产生了高达99.7%的OVA特异性T细胞杀伤效果，还显著重塑了肿瘤免疫微环境。免疫荧光染色显示，治疗后肿瘤内CD8+ T细胞、NK细胞和M1型抗肿瘤巨噬细胞的比例分别增加了20.3倍、14.8倍和35.2倍，而M2型促肿瘤巨噬细胞则减少了90%（图5g-j）。通过细胞清除实验，团队证实CD8+ T细胞、NK细胞和巨噬细胞对于SPEN的最终疗效缺一不可，证明了其同时激活了先天性和适应性免疫（图5k）。体外实验也证实，焦亡小体能将M2型巨噬细胞重编程为M1表型，并直接激活NK细胞，赋予其强大的肿瘤杀伤能力。

SPENEE原位重编程抗肿瘤免疫微环境。 a. CT26-OVA肿瘤上进行SPENEE介导的原位疫苗接种的示意图。荷CT26-OVA瘤小鼠每周两次用SPEN介导的EE应激处理，并在最后一次处理后1周评估免疫应答。 b,c. 荷CT26-OVA瘤小鼠中不同纳米佐剂的体内OVA特异性杀伤功效，通过代表性流式细胞术图（b）和量化分析（c）展示。n = 5只生物学独立小鼠。 d,e. 免疫小鼠中CD8⁺ T细胞内颗粒酶B⁺细胞毒性T细胞的百分比。n = 5只生物学独立小鼠。 f. 免疫小鼠中CD8⁺ T细胞内IFN-γ⁺细胞毒性T细胞的百分比。n = 5只生物学独立小鼠。 g. 免疫小鼠肿瘤切片的Opal多重免疫组化染色及相应的饼图，显示肿瘤微环境中各种淋巴细胞的比例。切片用CD4（粉色）、CD8（绿色）、NKp46（红色）、iNOS（黄色）、CD206（品红）和Foxp3（青色）进行免疫染色。比例尺，100 μm。 h,i. 从图g图像中量化的CD8⁺ T细胞与Foxp3⁺ Treg细胞的比值（h）和M1样巨噬细胞与M2表型的比值（i）。箱线图表示四分位距，中心线表示中位数。须线表示数据范围，延伸至最大值和最小值。Saline和SPEN组n = 26个区域，PEPAEE组n = 25个区域，SPEN组n = 15个区域，生物学独立。 j. 免疫小鼠中NKp46⁺细胞内颗粒酶B⁺ NK细胞的百分比。n = 5只生物学独立小鼠。 k. 在清除CD8⁺ T细胞、NK细胞或巨噬细胞后，SPENEE介导的疫苗在荷CT26瘤小鼠中的肿瘤抑制作用。n = 5只生物学独立小鼠。 l. 用不同焦亡小体处理后，骨髓来源巨噬细胞膜上MHC-I的表达。n = 3个生物学独立实验。 m. 用不同焦亡小体处理后，骨髓来源巨噬细胞上OVA提呈的共聚焦图像。比例尺，20 μm。 n. 不同焦亡小体对NK细胞的激活情况，通过膜上CD107a的表达来指示。 o. 通过乳酸脱氢酶法检测活化NK细胞对CT26细胞的体外杀伤能力。n = 3个生物学独立实验。所有数据显示为平均值 ± 标准差。统计学显著性通过单因素方差分析随后进行Dunnett多重比较检验进行分析。 

凭借其强大的免疫激活能力，SPEN在多种难治性肿瘤模型中展现出卓越的治疗效果。在双侧CT26肿瘤模型中，SPEN治疗不仅清除了原位肿瘤，还产生了强大的“远隔效应”，使远端未照射肿瘤的治愈率达到77.8%（图6b）。在体积高达400 mm³的B16黑色素瘤模型中，SPEN治愈了75%的荷瘤小鼠，有效防止了肿瘤复发。尤为突出的是，在MC38模型中，所有被SPEN治愈的小鼠在随后5个月内连续三次接受肿瘤细胞再挑战均未成瘤，这得益于其体内显著增加的中枢记忆T细胞（Tcm），证明了其诱导了超过150天的长期免疫记忆（图6c-d）。

最后，研究团队将SPEN与免疫检查点抑制剂（aPD-1）联合应用，以攻克免疫抑制性的“冷肿瘤”。在Panc02胰腺癌模型中，联合治疗使原发肿瘤的根除率提升至83.3%。在具有大型远端肿瘤（~100 mm³）的CT26模型中，联合治疗使远端肿瘤的治愈率高达80%。更重要的是，该联合疗法成功清除了预先建立的CT26腹腔多发转移灶和4T1肺转移灶，并在自发性MMTV-PyMT多结节肿瘤模型中，使总肿瘤负荷减少了90.6%（图6j-o），充分展示了其在抑制术后复发和转移方面的巨大潜力。

 SPEN实现强大的肿瘤免疫治疗和对多种癌症的持久免疫保护。 a,b. SPEN介导的EE应激对荷CT26瘤小鼠的肿瘤免疫治疗（Saline和SPEN组n = 10只小鼠；PEPAEE、SPINEE和SPENEE组n = 9只小鼠）。实验时间表示意图（a）。经EE应激治疗的原发肿瘤生长曲线（b）。CR，完全清除。 c,d. SPEN对荷MC38瘤小鼠的长期癌症预防能力。完全治愈的MC38肿瘤照片及SPEN免疫小鼠三次用MC38细胞再挑战的肿瘤生长曲线（c；n = 10只生物学独立小鼠）。CD8⁺ T细胞中中央记忆T细胞的量化（d）。n = 6只生物学独立小鼠；单因素方差分析随后进行Dunnett多重比较检验。 e,f. SPEN增强aPD-1对具有大体积远隔肿瘤（~100 mm³）的荷CT26瘤小鼠的免疫治疗效果（n = 5只生物学独立小鼠）。光动力治疗肿瘤的生长曲线（e）和未经EE应激的远隔肿瘤的生长曲线（f）。 g. 联合疗法对具有多个腹膜肿瘤转移结节的CT26-luc肿瘤模型的远隔治疗效果。通过腹腔注射建立多发性腹膜转移。 h,i. 联合疗法在已建立的肺转移4T1-luc肿瘤模型中的远隔治疗效果。实验时间表示意图。通过尾静脉注射建立肺转移（h）。治疗前后腹膜肿瘤转移的发光成像（i）。 j–o. SPEN和PD-1阻断联合疗法对具有多个肿瘤结节的自发性MMTV-PyMT模型的远隔治疗效果（Saline组n = 5只；SPEN联合aPD-1组n = 7只；生物学独立小鼠）。实验时间表示意图（j）。MMTV-PyMT小鼠治疗前（第0天）和治疗结束时（第32天）的代表性照片（k）。治疗后的MMTV-PyMT小鼠切取的乳腺肿瘤组织照片（l）。肿瘤切片的整体成像。绿色表示肿瘤细胞。比例尺，800 μm（m）。自发性乳腺肿瘤的重量（n）和数量（o）。采用Welch校正的双尾Student's t检验。所有数据显示为平均值 ± 标准差。

总结与展望

总之，这项研究不仅从机理上揭示了早期内体应激诱导的焦亡细胞死亡具有强大的免疫原性功能，阐明了焦亡衍生囊泡的免疫启动机制，更成功开发了一种名为SPEN的系统注射型焦亡诱导纳米材料。它通过在肿瘤原位生成个性化的“疫苗样焦亡小体”，巧妙解决了传统个性化癌症疫苗制备复杂、成本高昂的难题，并安全、高效地激活了系统性抗肿瘤免疫。这一创新平台为开发下一代精准、高效、通用的个性化癌症免疫疗法开辟了新路径，具有极高的临床转化前景。

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